Enzimas

Enzimas

Fundamentos

Las enzimas son biocatalizadores que aceleran las reacciones químicas. El proceso organizado del metabolismo solo es posible porque cada célula dispones de un contenido enzimático determinado genéticamente. Solo de este modo pueden tener lugar secuencias de reacciones coordinadas. Las enzimas también participan en muchos mecanismos de regulación que de este modo permiten que el metabolismo se adapte a diferentes situaciones. Casi todas las enzimas son proteínas pero también hay ácidos nucleicos catalíticamente activos conocidos como “ribozimas”.

• Actividad enzimática

La acción catalítica de una enzima, o sea su actividad, se mide cuantificando el incremento de la velocidad de reacción en condiciones perfectamente definida, es decir midiendo la diferencia del recambio (en color violeta) entre la reacción catalizada (color amarillo) en un tiempo determinado. Normalmente las velocidades de reacción se expresan como cambios de concentración por unidad de tiempo (mol.l^(-1).s^(-1)). Como la actividad catalítica es independiente del volumen, la actividad enzimática se expresa indicando el recambio por unidad de tiempo llamada katal  (kat,mol.s^(-1)). Otra unidad usual es la unidad internacional U (μmol de recambio.(min)^(-1), cuya equivalencia es 1U=16,7 nkat).

• Especificidad de acción u especificidad de sustrato

La actividad de la mayor parte de las enzimas es muy específica tanto por el tipo de reacción catalizada (especificidad de acción) como por los compuestos (sustratos) cuya modificación catalizan (especificidad de sustrato). En el recuadro B del siguiente recuadro se ejemplifica la acción de una enzima que puede ser altamente específica (la de tipo A, en el esquema superior) y catalizar solo la degradación de un tipo de enlace, siempre y cuando el sustrato tenga la estructura correcta. Otras enzimas (como la B indicada en la parte central) tienen una especificidad de acción limitada pero aceptan una gran variedad de sustratos. Las enzimas de tipo C, con poca especificidad de acción por el sustrato son muy raras.

• Clases de enzimas

Actualmente se conocen unas 2000enzimas y para su clasificación se utiliza un sistema que toma en cuenta tanto la especificidad por de acción como la especificidad por el sustrato. Cada enzima está indicada por un número EC de varias cifras en el catálogo de enzimas. El primer número indica que la enzima corresponde a una de las seis clases principales de enzimas, los dos números siguientes definen la subclase y la sub-subclase y el último número es el número progresivo dentro de la subclase.

En las seis clases principales se incluyen las enzimas que tienen un mecanismo de acción similar.

1. Las oxirreductasas catalizan la transferencia de los equivalentes reductores entre dos sistemas redox.
2. Las transferasas catalizan la transferencia de otros grupos de una molécula a otra. Las oxirreductasas y las transferasas en general requieren coenzimas.
3. Las hidrolasas transfieren grupos y el aceptor siempre es una molécula de agua.
4. Las liasas, llamadas con frecuencia “sintasas”, catalizan la ruptura o la formación de uniones químicas, con la formación o la eliminación de enlaces dobles.
5. Las isomerasas desplazan grupos dentro de una molécula sin cambiar la fórmula general del sustrato.

Las reacciones catalizadas por las ligasas (“sintetasas”, esta vendría a ser la sexta clase) son reacciones de unión de moléculas dependientes de la energía y por eso siempre están acopladas con la hidrolisis de nucleósidos trifosfatos (generalmente ATP).

Además del nombre de las enzimas generalmente indicamos su número EC.  

Bioquímica, texto y atlas; Koolman and Röhm; Editorial médica
Panamericana, 3ª Edición; parte 3 pag 89.

Catálisis enzimática

Las enzimas son catalizadores extraordinariamente activos que en general aceleran unas (10)^12 veces  más la velocidad de la reacción en la que participan. De todos modos, para entender mejor el mecanismo de la catálisis enzimática es conveniente considerar primero una reacción  no catalizada.

• Reacción no catalizada

Tomemos como ejemplo una reacción del topo A+B→C+D. Los reactantes A y B en solución acuosa están rodeados por una capa de moléculas de agua (capa de hidratación) que por el movimiento calórico se mueven en direcciones aleatorias y solo pueden reaccionar entre si cuando chocan en una posición determinada que favorezca la reacción, lo que no es muy probable y por ende ocurre muy rara vez. Antes que tenga lugar la transformación en los productos C + D el complejo AB producido por el choque debe originar un estado de transición para lo cual requiere una energía de activación (Ea) considerable. Dado que solo algunas moléculas del complejo AB pueden aportar dicha energía, el estado de transición se produce aún más difícilmente que el complejo de choque de ambas moléculas. En solución gran parte de la energía de activación se emplea para eliminar la capa de hidratación entre A y B, pero también participan los desplazamientos de las cargas y otros procesos químicos que ocurren dentro de los reactantes. Debido a estas limitaciones en ausencia del catalizador la transformación solo es posible muy rara vez y la velocidad de reacción (v) es pequeña, independientemente  de que la degradación sea posible desde el punto de vista termodinámico, es decir cuando ∆G<0.

• Reacción catalizada por enzimas

Se representa un mecanismo secuencial en el que los sustratos A y B se unen a la enzima uno después del otro y los productos C y D también se van liberando uno después del otro. Otro mecanismo posible es el llamado “mecanismo de ping-pong”.

Las enzimas se unen a los reactantes específicamente en su centro activos quedan orientadas de tal modo que quedan orientadas que pueden adoptar la posición óptima. La aproximación y orientación de sustratos incrementa mucho la probabilidad de que se formen los complejos productivos A-B. Durante la unión con el sustrato se eliminan las capas de hidratación y por la exclusión del agua en el centro activo de la enzima durante la catálisis se obtienen condiciones totalmente diferentes de las que existen en solución. Un tercer factor importante es la estabilización del estrato de transición por interacciones entre los residuos de los aminoácidos de las proteínas y del sustrato. Esto disminuye aún más la energía de activación necesaria para dar lugar al estado de transición, además muchas enzimas tomas ciertos grupos de los sustratos durante la catálisis.

Las trasferencias de portones son especialmente frecuentes. Esta catálisis enzimática acido-base es mucho más efectiva que el intercambio de protones entre ácidos y bases en la solución. Algunos grupos químicos también se unen a residuos de aminoácidos de las enzimas o coenzimas por un efecto llamado catálisis covalente.

• Fundamentos de la catálisis enzimática        

Aunque resulta difícil cuantificas la participación de cada uno de los efectos catalíticos, es esencial considerar la estabilización del estado de transición que lleva a cabo la enzima. No importa cuán fuerte sea la unión con el sustrato, que aumentara la energía de activación de reacción en lugar de disminuirla, sino la del estado de transición. La altísima afinidad de muchas enzimas en comparación con análogos del estado de transición confirma este concepto.

Bioquímica, texto y atlas; Koolman and Röhm; Editorial médica 
Panamericana, 3ª Edición; parte 3 pag 91.

Cinética enzimática 

La cinética de las reacciones catalizadas por enzimas, se determina en primer lugar por las propiedades del catalizador de modo que es más compleja que la cinética de las reacciones no catalizadas.

• Cinética de Michaelis-Menten (ecuación de Michaelis-Menten)

En ausencia de una enzima la velocidad de reacción (v) es proporcional a la concentración de la sustancia. La constante k es la constante de velocidad de reacción no catalizada. Como todos los catalizadores la enzima E (concentración total [E]g) genera una vía de reacción: primero se une la sustancia A a la enzima E. Si esta reacción se encuentra en equilibrio químico, con ayuda de la ley de acción de las masas y considerando el hecho de que [E]g=[E]+[E], la concentración [EA] del complejo enzima-sustrato puede expresarse como función de [A]. Por lo tanto la constante de Michaelis (Km) describe la situación de equilibrio de la reacción. Además sabemos que Kcat>K; en otras palabras, el sustrato unido a la enzima reacciona hacia la sustancia B mucho más rápido que hacia la sustancia A solamente. Kcat, el número de recambio (o constante catalítica) de la enzima corresponde al número de moléculas del sustrato trasformadas por una molécula de enzima en un segundo. Como la transformación A→B la formación de B a partir de EA también es una reacción de primer orden, es decir, que es válido afirmar que  v=k.[EA]. Combinado esta igualdad con la expresión de EA recién derivada se obtiene la ecuación de Michaelis-Menten.

Además de las variables V y [A] la ecuación contiene dos parámetros que no dependen de la concentración del sustrato [A] sino que describe propiedades de la enzima. El producto Kcat.[E]g es el límite de la velocidad de la reacción con un concentración de [A] muy alta, la velocidad máxima (Vmáx) de la reacción. La constante de Michaelis (Km) caracteriza la afinidad de la enzima por su sustrato. Corresponde a la concentración del sustrato. Corresponde  a la concentración del sustrato [A], a la cual v alcanza la mitad de la Vm (cuando v=Vmáx/2 , [A]/(Km+[A])=1/2 , es decir que [A]=Km). Una alta afinidad de la enzima por el sustrato significa que el valor de Km es bajo y a la inversa. 

  

Las propiedades catalíticas de las enzimas reciben la influencia de numerosos factores que deben ser controlados y optimizados en su totalidad si se desea que las mediciones de la actividad enzimática tengan sentido y sean reproducibles: físicas (temperatura, presión), las propiedades químicas de la solución (valor del pH, fuerza iónica) y la concentración de sustratos, cofactores e inhibidores importantes.  

• Dependencia de la actividad enzimática del pH y de la temperatura

La acción de las enzimas depende mucho del valor del pH. Si se representa gráficamente la actividad enzimática en función del valor del pH por lo general se obtiene una curva con forma de campana. En las enzimas animales el pH óptimo se aproxima a 7. La forma acampanada de la curva de actividad pH se produce porque los residuos de aminoácidos con grupos ionizables en la cadena lateral son esenciales para la catálisis. En el ejemplo  estos son un grupo básico B (pKa=8), que debe ser protonado para ser activo, y un segundo aminoácido  AH (pKa=6), que solo es catalíticamente activo es estado disociado.

La dependencia de la actividad enzimática de la temperatura en general es asimétrica. Cuando aumenta la temperatura se observa una aceleración inicial de la reacción debido  al aumento del calor generado por el movimiento de las moléculas. A determinad temperatura la enzima se torna inestable y luego de un corto intervalo a esa temperatura la actividad empieza a decrecer por desnaturalización hasta perderse totalmente. La temperatura óptima para las enzimas de los organismos superiores rara vez supera los 50°C mientras que las enzimas de las baterías termófilas, que se encuentran en fuentes calientes pueden seguir siendo activas a 100°C.

Bioquímica, texto y atlas; Koolman and Röhm; Editorial médica
Panamericana, 3ª Edición; parte 3 pag 95.

• Especificidad por el sustrato       

Las enzimas reconocen a sus sustratos de manera muy específica. La causa reside en estructura y la conformación del centro activo de la enzima que está adaptado a su sustrato.

• Cinética de dos sustratos  

Casi todas las enzimas tienen más de un sustrato y más de un producto. Por otro lado rara vez se unen más de dos sustratos al mismo tiempo. Las reacciones de dos sustratos del tipo A+B→C+D pueden desarrollarse de diferentes maneras. Además de mecanismos secuenciales en la que todos los sustratos se unen a una sucesión determinada antes de la liberación del producto también hay mecanismos en los cuales el primer sustrato (A) es unido e inmediatamente dividido, una parte de este sustrato permanece unida a la enzima y será transferida al segundo sustrato (B) luego de la liberación del primer producto (C). Este “mecanismo ping-pong” es utilizado por ejemplo por las transaminasas. 

Inhibidores

En el curso del metabolismo hay muchos compuestos que pueden influir sobre las actividades enzimáticas y por ende sobre el metabolismo propiamente dicho. Entre ellos son de especial interés los inhibidores enzimáticos. Gran parte de los medicamentos actúan como inhibidores de enzimas y por eso la experimentación en cinética química ocupa un lugar destacado en el desarrollo y la evaluación de los fármacos. Los metabolitos naturales también pueden participar como inhibidores en los procesos de regulación.

• Tipos de inhibidores

Casi todos los inhibidores actúan de manera reversible, es decir no provoca cambios permanentes en la célula. La forma de acción de un inhibidor, o sea su tipo de inhibición, se puede determinar comparando las cinéticas de las reacciones inhibidas y no inhibidas (B). En el recuadro A del cuadro siguiente se comparan los mecanismos de acción de los inhibidores de tipo competitivo con los de tipo no competitivo. Para la regulación del metabolismo es particularmente importante la inhibición alostérica.

Los análogos de los sustratos se asemejan en sus propiedades al sustrato de una enzima determinada. Pueden unirse a la enzima pero no pueden continuar degradándola y bloquean de manera reversible una parte de la molecular enzimática presente. Por eso se requiere una concentración aún más elevada  del sustrato para obtener la mitad de la velocidad máxima de la reacción: la constante de Michaelis (Km) aumenta . Las concentraciones más altas de sustrato desplazan nuevamente al inhibidor y por eso la velocidad máxima de reacción (Vmáx) no resulta afectada en este tipo de inhibición. Como el sustrato y el inhibidor compiten por el mismo sitio de unión de la enzima esta clase de inhibición se considera de tipo competitivo. Los análogos del estado de transición también pueden actuar en forma competitiva.

Cuando un inhibidor reaccione con uno de los grupos importantes reacciona con uno de los grupos importantes para la reacción, sin afectar a unión con el sustrato la inhibición de tipo no competitivo. En el caso de Km permanece invariable. Por el contrario, la concentración de la enzima con capacidad funcional [E]g aumenta y por ende disminuye Vmáx de la reacción. Los inhibidores no competitivos generalmente actúan de forma no reversible porque modifican los grupos funcionales de la enzima. Los “sustratos suicidas”  son análogos del sustrato que además tiene un grupo capaz de reaccionar. Al comienzo se une de manera reversible para después unirse mediante enlaces covalentes al centro activo de la enzima. Por lo tanto su mecanismo de acción también es no competitivo.

Los inhibidores alostéricos se unen en sitios diferentes, fuera del centro activo  induce un cambio en la conformación de la proteína enzimática que reduce indirectamente la actividad de esta. Los efectos alostéricos se presentan prácticamente solo en el caso de las enzimas oligoméricas. La cinética de esas enzimas no puede describirse usando el modelo simplificado de Michaelis-Menten.

Bioquímica, texto y atlas; Koolman and Röhm; Editorial
 médica Panamericana, 3ª Edición; parte 3 pag 97.

Coenzimas

En muchas reacciones catalizadas por enzimas, los electrones o los grupos de átomos de un sustrato son transferidos a otro. En las reacciones de este tipo siempre participan otras moléculas que son encargadas de transportar dichos grupos. Estas moléculas auxiliares se conocen como coenzimas pero dado que no son catalíticamente activas por si mismas la denominación usual de co-sustratos es más adecuada. A diferencia d los sustratos, que generalmente son específicos de una enzima las coenzimas funcionan con muchas enzimas que tienen distinta especificidad de sustrato. Aquí las coenzimas serán diferenciadas de forma arbitraria en coenzimas transferidoras de grupos y coenzimas redox. En sentido estricto, las coenzimas redox también son transferidoras de grupos, los llamados equivalentes reductores.

Según el tipo de interacción que tengan con enzimas se diferencian las coenzimas solubles y los grupos protéticos. Las coenzimas solubles se unen a la enzima como sustrato, experimenta una transformación química y son liberadas nuevamente. La forma original de la coenzima se regenera en una segunda reacción independiente. Por el contrario, el grupo protético está compuesto por coenzimas que están unidas firmemente a una enzima y por lo tanto no se separan de ella durante la reacción. Los grupos unidos a la coenzima son transferidos posteriormente a otro sustrato o a la coenzima de la misma enzima.

Casi ninguna de las coenzimas animales puede ser sintetizada directamente. Sus precursores (vitaminas) debes de ingeridos en la alimentación.    

Bibliografía:

-Bioquímica, texto y atlas; Koolman and Röhm; Editorial médica Panamericana, 3ª Edición; parte 3 pag 88-110.