Tipos básicos de tinción en células eucariotas

Tipos básicos de tinción en células eucariotas

Todos los organismos comparten los mismos constituyentes básicos: las células. Aunque las características de las células varían de una célula a otra, existen aspectos básicos que comparten todos los tipos celulares como son: Una membrana plasmática externa que rodea la célula, el modo de almacenamiento de la información (en polinucleótidos), un metabolismo que transforma su medio para satisfacer sus necesidades bioquímicas, todas las células establecen respuestas ante los estímulos tanto internos como externos a corto y largo plazo (irritabilidad y evolución), etc.

En esta práctica comprobaremos que son las células los constituyentes básicos de los organismos al observar muestras de tejidos tanto animal como vegetal. También observaremos las diferentes formas que pueden tomar las células tanto animales como vegetales y estableceremos tanto puntos en común entre ambos tipos celulares como sus divergencias. 

Materiales

-Microscopio compuesto.

-Láminas y laminillas.

-Solución de azul de metileno.

-Solución de lugol.

-Colorante Wright.

-Pinzas.

-Lancetas hematológicas.

-Hoja de afeitar.

-Goteros.

-Allium cepa (cebolla).

-Alcohol yodado, agua destilada.

-Algodón.

Desarrollo 

A. Observación de las células epiteliales de la mucosa bucal:

1. Cuidadosamente con el extremo de una lámina limpia o un hisopo, raspe la superficie interna de la mejilla; al hacer esto la fricción provocada entre el hisopo o lamina y la mejilla provocará que la célula se desprenda del tejido bucal y sea recogida por el hisopo o lamina.
2. Deposite el material obtenido en una lámina portaobjeto (frotis).
3. Secar al medio ambiente la lámina que contiene la muestra por 5 minutos.
4. Cubrir la muestra con azul de metileno durante 10 minutos.
5. Eliminar el exceso de colorante y lavar con agua corriente.
6. Secar la lámina y observar al microscopio.

Frotis bucal humano, células epiteliales de la mucosa bucal,
tinte: azul de metileno, aumento: 100X. Las células
poseen un aspecto amorfo con un núcleo intensamente teñido

Frotis bucal, células epiteliales de la mucosa bucal,
tinte: azul de metileno, aumento: 400X. 

B. Observación de las células epiteliales del catáfilo de cebolla (allium cepa):

Las células del catáfilo de la cebolla no poseen función fotosintética, por lo que no observaremos cloroplastos; sin embargo, si podremos visualizar otras estructuras celulares.

1. Extraiga un pequeño fragmento de la epidermis interna del catáfilo de cebolla.
2. Utilizando la lámina y laminilla, monte la preparación, coloreando con solución de lugol.
3. Observe al microscopio.

Allium cepa, catáfilo, se ha colocado la muestra en un medio
de lugol, aumento: 100X. Las células están apiladas, poseen formas
casi geométricas y carecen de cloroplastos,

C. Observación de formas de núcleo en leucocitos humanos:

Los leucocitos son un tipo celular del tejido conectivo con capacidades inmunológicas, se dividen en granulocitos y agranulocitos. Los granulocitos, a su vez, se dividen en eosinófilos, neutrófilos y basófilos. Los agranulocitos se subdividen en monocitos y linfocitos. Cada uno de estos tipos celulares posee características externas distintivas que nos permite reconocerlos. 

1. Desinfectar el dedo anular con alcohol yodado y algodón. Con una lanceta estéril punzar el dedo y dejar caer una gota de sangre sobre un extremos de la lámina portaobjetos.
2. Con ayuda de otra lámina formar un ángulo de 45º y realizar un frotis, tratando de esparcir homogéneamente la gota de sangre sobre la superficie de la lámina.
3. Dejar secar la preparación 5 minutos al ambiente y proceder luego a la coloración.
4. Cubrir el frotis con el colorante de Wright por 1 minuto.
5. Sin eliminar el colorante agregar agua destilada y dejar actuar por 10 minutos.
6. Eliminar luego el colorante y lavar suavemente con agua de caño.
7. Dejar secar la lámina coloreada.
8. Una vez que la lámina coloreada ha secado, observar al microscopio con el objetivo de inmersión y aceite de inmersión.

Extraído de:
Guía de laboratorio de Biología celular UNMSM, Lazo F, Suyo M, Vivas D, Lima, 2016, pág 11-14 .

Reconocimiento indirecto de la presencia de bacterias

Reconocimiento indirecto de la presencia de bacterias

Presentación

Aun si no poseemos el material necesario como para observar en forma directa la presencia de bacterias podemos determinar su existencia, aunque no de forma directa. Esto tiene aplicaciones directas ya que existen una serie de situaciones en las que incluso si tenemos la capacidad de observar a las bacterias directamente elegimos no hacerlo, muestra de esto es el test del aliento desarrollado para evitar realizarle una biopsia al paciente y en vez de ello analizar los compuestos producidos por los microorganismos, siendo estos compuestos propios solo de ellos.

En esta entrada analizaremos una de las formas básicas de evidenciar la presencia de bacterias.

Marco teórico

Las bacterias poseen una serie de enzimas implicadas en su metabolismo que extraen los átomos de hidrógeno de sustratos específicos, liberándolos al medio. Este grupo de enzimas es conocido como deshidrogenasas. En esta práctica no nos concentraremos en un tipo específico de enzima sino en los productos de estas: los hidrógenos.

Al adicionar azul de metileno a un medio contaminado con bacterias, y por ende que posee enzimas deshidrogenasas, este reacciona con los átomos de hidrógeno producidos y se reduce, al reducirse pierde su coloración azul y se torna translúcida. 

Con todo esto, si observamos que la muestra inicialmente teñida de azul por el azul de metilo se va decolorando hasta volver a su color original podemos tener la certeza de que ese medio posee átomos de hidrógeno que posiblemente hayan provenido de sustratos  del medio catalizados por las enzimas deshidrogenasas de las bacterias.

Materiales

-Cinco muestras de leche de diferente procedencia.

-Azul de metileno.

-Cinco tubos de ensayo 15x150 mm.
-Cinco tapones para tubo de ensayo.

-Goteros.

-Marcador indeleble.

-Baño María de laboratorio.

Procedimiento

1. Obtener cinco muestras de leche de diferente procedencia (en polvo, materna, fresca contaminada, yogurt bebible, evaporada).
2. Vierta 5 mL de las muestras en cinco tubos de ensayo diferentes.
3. Rotular con el marcador cada tubo de ensayo indicando su contenido.
4. Adicionar 2 gotas de azul de metileno a cada tubo.
5. Tapar cada tubo con el tapón estéril.
6. Colocar los tubos en baño María a 37ºC,  esperar una hora.

Resultados y conclusiones

La siguiente tabla muestra la coloración inicial de las diferentes muestras:

Una vez transcurrido el tiempo observamos todas la muestras, excepto la muestra de leche contaminada, mantienen su coloración inicial. 

A partir de estos resultados confirmamos la presencia de enzimas deshidrogenasas en la leche contaminada y con ella la presencia de bacterias en ella.

Este experimento puede ser repetido con otros medios líquidos como agua estancada, agua potable y agua de río, etc. Un posible inconveniente es la sensibilidad de este experimento ya que requiere de una gran población bacteriana para poder evidenciar un cambio en la coloración, esto limita el tipo de muestras que pueden ser analizadas. Este inconveniente óptico puede ser corregido utilizando un espectrofotómetro para encontrar la variación en la coloración.

Extraído de:
Guía de laboratorio de Biología celular UNMSM, Lazo F, Suyo M, Vivas D, Lima, 2016, pág 8, 9 y 10 .

Tinción de Gram

Tinción de Gram

Es la coloración más empleada en bacteriología, fue propuesta por el microbiólogo danés Christian Gram en 188. Esta técnica permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias: Gram positivas (+) y Gram negativas (-). Su fundamento radica en la diferencia estructural a nivel de su pared celular en ambos grupos. Ello se debe a la precipitación a nivel del citoplasma del cristal violeta con la solución de Lugol, formando un compuesto insoluble Cristal violeta-Lugol;  en algunas bacterias (Gram +) no se puede extraer con solvente alcohol-acetona, mientras que en otras (Gram -) sí se puede extraer. Debido a que las Gram negativas no se puede teñir de cristal violeta, se necesita una tinción de fondo con safranina o fucsina básica para permitir su visualización. 

Las bacterias Gram positivas poseen una pared celular bastante gruesa que rodea a la membrana citoplasmática; se compone de peptidoglicano o mureina y ácidos teicoicos.

Las Gram negativas tienen una pared celular más delgada que se encuentra  rodeada por una membrana externa, es decir, las bacterias gram negativas presentan dos membranas. La membrana externa presenta una molécula denominada lipopolisacárido o LPS.

Procedimiento de la coloración Gram

1. Prepara el frotis de la muestra en un portaobjetos limpio.
2. Fijar la muestra a la llama del mechero en forma suave.
3. Cubrir la preparación con cristal violeta o violeta de genciana y dejar actuar por un minuto.
4. Lavar con agua destilada.
5. Cubrir el preparado con lugol y dejar actuar por un minuto.
6. Lavar con agua destilada.
7. Decolorar con alcohol acetona hasta que no se desprenda más colorante.
8. Lavar con agua destilada.
9. Cubrir la preparación con safranina o fucsina de Ziehl y dejar actuar por 30 segundos. 
10. Lavar con agua destilada.
11. Secar la preparación y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

Resultado

Las bacterias Gram positivas aparecen de color violeta y las Gram negativas de un color rosado o granate. A continuación se mostrarán algunos ejemplos de bacterias tanto Gram positivas como negativas.

Bacterias Gram positivas

Bacillus sp

Streptococcus mutans

Staphylococcus sp

Bacterias Gram negativas

Salmonella sp

Escherichia coli

Neisseria sp.

Extraído de: Tomás Agurto S., Técnicas de coloraciones de células y tejidos, editorial Imprenta Unión, pag 88-89.

Coloración de bacterias, aspectos teóricos

COLORACIÓN DE BACTERIAS, ASPECTOS TEÓRICOS

Colorante: 

Es aquella sustancia que tiene la propiedad de comunicar color a otros cuerpos de cualquier naturaleza. Para que una sustancia se comporte como un colorante debe estar compuesto por:

Cromógeno:  Son las moléculas que poseen potencialidades de coloración, conferido por un radical llamado cromóforo.

Cromóforo:  Grupo de átomos no saturados , susceptibles a dar coloración a las moléculas de las cuales forman parte, la fuerza de los cromóforos varía con la naturaleza de sus átomos y de su estructura. 

Auxócromo: Grupo de átomos no saturados, debido a esta insaturación influye y pueden ser: simples (Presentan un átomo no saturado p. ej el NH2) o compuestos (Cuando cada uno encierra dos átomos no saturados p. ej. NHNH2).

Mordiente:

Son sustancias que actúan entre el tejido y el colorante para que formen sales, de esta manera la coloración queda fijada fuertemente, puede ser colocado sobre el preparado antes o después de la acción del colorante principal, así, el fenol y oxalato de amonio se mezclan con el cristal violeta como colorante en el método Gram. Las estructuras bacterianas se colorean por diversos procedimientos con colorantes propios de cada estructura: Cápsula, espora, flagelo, corpúsculos metacromáticos, membranas y las formas ácido resistentes.

Tipos de colorantes:

1. De acuerdo a su origen:

 a) Naturales: Colorantes obtenidos a partir de la naturaleza ya sea de fuentes animales o vegetales.        Ejemplo: Carmín, hematoxilina.

 b) Artificiales: Colorantes obtenidos mayormente como derivado del alquitrán de hulla. Ejemplo:          Cristal violeta, safranina, etc.

2. De acuerdo a su composición química: 

 a) Básicos: Colorante que en su parte cromófora llevan carga eléctrica positiva, la que tendría una fuerte afinidad por los grupos electronegativos que normalmente presentan las bacterias en su protoplasma como los ácidos nucleidos y derivados. Ejemplo: Fucsina básica, Violeta de metilo, Cristal violeta, etc.

 b) Ácidos: Colorantes que en su parte cromófora lleva cargas eléctricas negativas que tienen fuerte afinidad por los componentes electropositivos de la célula (citoplasma). Ejemplo: Anaranjado de metilo, Pardo Bismarck, Ácido fénico, etc.

 c) Neutro: Resulta de la combinación de los colorantes ácidos y básicos.

Métodos de coloración:

Coloración simple:

Empleado para comprobar la presencia de microorganismos en cualquier material, revelar tamaño, forma y disposición de las células microbianas. Se puede utilizar colorantes ácidos o básicos los que reaccionarán con la célula más no así con el medio que la rodea.

Coloración diferencial:

Los microorganismos difieren física y químicamente entre sí y por esto reaccionan de una manera distinta frente  a un determinado procedimiento de tinción. En una metodología de tinción que permite distinguir los diferentes tipos de bacterias es necesaria la utilización de más de un tipo de tinte para contrarrestar los tipos de bacterias. Un ejemplo de esta es la tinción Gram.

-Extraído de: Tomás Agurto Sáenz, técnicas de coloraciones de células y tejidos en microbiología, parasitología e histología, Editorial imprenta  unión, 2007, pág  87, 88.