Ósmosis

Ósmosis 

I. Introducción:

Una célula no es una isla, es un componente dinámico que interacciona con su medio modificándolo y adaptándose a él. 

La ósmosis es el proceso mediante el cual el agua pasa a través de una membrana semipermeable a favor del gradiente de concentración, es decir, si tenemos sustancias disueltas de un lado de la membrana, por ejemplo el izquierdo, y del otro lado tenemos una baja o nula cantidad de sustancias el agua se desplazará desde el lado derecho de la membrana hacia el lado izquierdo debido a que las moléculas de agua que interactúan con el soluto no son consideradas en el equilibrio de difusión a través de la membrana entonces tendríamos más moléculas que entran al lado izquierdo que las que salen; por ello pareciera que el agua se estaría desplazando hacia la región izquierda a la membrana. Esto puede ser observado de manera más evidente en un tubo en "U" donde se coloca una mayor cantidad de soluto por una de las aberturas.

Una membrana semipermeable impide el paso de solutos pero permite el paso del agua.

II. Materiales de la práctica:

-Microscopio compuesto

-Laminas y laminillas

-Catáfilo de cebolla

-Solución de cloruro de sodio al 0.2%, 0.9% y 5%

-Hojas de elodea

-Goteros

-Gillette 

III. Procedimiento:

• Medio isotónico:

1. Coloque una gota de sangre sobre una lámina portaobjeto.
2. Corte una sección del catafilo de una cebolla y colóquelo sobre una lamina portaobjetos.
3. Coloque una hoja de elodea sobre una lámina portaobjetos.
4. Añadir 1 gota de NaCl 0.9% a cada una de las láminas. Cubrir con laminilla.

Células sanguíneas huamanas, solución salina 0.9%. Aumento 1000X

Las células en medio isotónico no experimentan cambios en el volumen de agua que poseen ya que la concentración de sales en el medio extracelular es la misma que en el medio intracelular.

• Medio hipertónico:

1. Coloque una gota de sangre sobre una lámina portaobjeto.
2. Corte una sección del catafilo de una cebolla y colóquelo sobre una lamina portaobjetos.
3. Coloque una hoja de elodea sobre una lámina portaobjetos.
4. Añadir 1 gota de NaCl 5% a cada una de las láminas. Cubrir con laminilla.

Allium cepa , catáfilo, solución salina 5%, aumento 400X.

Cuando las células se exponen a una medio hipertónico, es decir, cuando la concentración de sales es mayor en el medio extracelular el agua escapa de la célula. En las células vegetales, producto de la deshidratación la membrana plasmática, este fenómeno se llama plasmólisis. En las células animales se produce el mismo fenómeno aunque como las células animales carecen de pared celular la célula reduce su volumen, se "arruga", este fenómeno se denomina crenación.

• Medio hipotónico:

Allium cepa, catáfilo, solución salina 0.2%, aumento 100X

1. Coloque una gota de sangre sobre una lámina portaobjeto.
2. Corte una sección del catafilo de una cebolla y colóquelo sobre una lamina portaobjetos.
3. Coloque una hoja de elodea sobre una lámina portaobjetos.
4. Añadir 1 gota de NaCl 0.2% a cada una de las láminas. Cubrir con laminilla.

Cuando una célula se expone a una solución hipotónica, es decir, la concentración de sales es mayor en el medio intracelular. El agua ingresa dentro de ella y aumenta su volumen. Las células vegetales 

poseen una pared celular que las protege de la lisis, por lo que la célula, en sí, se vuelve turgente. Por el contrario, las células animales carecen de esa protección por lo que el agua ingresa dentro de ellas hasta que la membrana celular se fractura y el agua escapa de ella. Este fenómeno se llama hemólisis en las células sanguíneas.

-Extraído y modificado de:

Guía de laboratorio de Biología celular UNMSM, Lazo F, Suyo M, Vivas D, Lima, 2016, pág 26-31 .

Ciclo Nucleolar

Ciclo Nucleolar

I. Introducción:

En el nucleolo es una estructura transitoria que resulta de la acumulación de material nuclear (proteínas y ácidos nucleicos) por la síntesis continua del ARNr y el ensamblaje de las proteínas con RNA para su posterior transporte al citoplasma.

En células en proliferación el nucléolo es una organelo que presenta una fase de dispersión durante la mitosis y reconstitución durante la telofase. 

Este comportamiento de desorganización y reaparición del nucléolo es denominado ciclo nucleolar. 

En células meristemáticas de Allium cepa después del tratamiento con nitrato de plata se muestran un par de nucleolos. 

II. Materiales:

-Raíces de Allium cepa

-Nitrato de plata al 2%

-Ácido acético al 50%

-Papel filtro

-Pinzas

-Gillette

-Mezcla de solución de formol al 10%-Hidroquinona al 1% (1:1)

-Láminas y laminillas

-Estufa

-Microscopio compuesto

III. Procedimiento:

1. Fijación en una mezcla 1:1 formol 10% e hidroquinona 1% por 1 a 2 horas a temperatura ambiente.
2. Lavar tres veces con agua destilada, 10 minutos cada vez.
3. Introducir las raíces en nitrato de plata al 2% a 70ªC en oscuridad durante 10 a 15 horas.
4. Lavar de nuevo con agua destilada 3 vece, 10 minutos por vez.
5. Trasladar a temperatura ambiente por 1 a 2 horas e solución fijadora (nueva).
6. Realizar el aplastado (squash) de las raíces en dos o tres gotas de ácido acético al 50% 
7. Cubrir con laminilla y observar al microscopio.

Allium cepa, meristemo apical radicular, impregnación argéntica,
aumento 400X. A: Célula en interfase. El puntero señala una
célula en telofase tardía donde se pueden observar
los cuerpo paranucleolares.

Allium cepa, meristemo apical radicular, impregnación argéntica,
aumento 400X. La célula señalada con el puntero
se encuentra en interfase.

Allium cepa, meristemo apical radicular, impregnación argéntica,
aumento 400X. Se observan células en metafase o anafase, todas
ellas carecen de nucléolo

Allium cepa, meristemo apical radicular, impregnación argéntica,
aumento 400X. La célula que está señalada con el puntero se 
encuentra en profase por la desorganización del nucleolo
(cuerpos paranucleolares)

Extraído y modificado de:

Guía de laboratorio de Biología celular UNMSM, Lazo F, Suyo M, Vivas D, Lima, 2016, pág 44, 45.

Ciclo celular e índice de fases

Ciclo celular

I. Introducción:

La división celular es la base sobre la que se erige toda la vida, si ella un organismo no podría mantenerse en el tiempo. 

La división celular establece dos etapas. En la primera, la célula se divide originando dos células hijas con el mismo material celular y genético. 

La mitosis es un método exacto para controlar la transmisión de los rasgos de herencia de una célula a otro durante la división celular. Es el mecanismo que genera nuevas células y reemplaza las células dañadas en los organismos multicelulares. El término mitosis se refiere a la secuencia de cambios que ocurre en el núcleo antes de la división celular.

Se divide en cuatro fases:

• Profase: Los cromosomas se visualizan mientras que los nucléolos inician el proceso de desorganización. Los filamentos cromosómicos, anteriormente extendidos, se enrollan, volviéndose cortos y gruesos. En la profase tardía se aprecia que cada cromosoma está constituido por dos cromátides. La envoltura nuclear empieza a desaparecer.
• Metafase: Se caracteriza por la aparición del huso mitótico. Los cromosomas alcanzan el plano ecuatorial. 
• Anafase: Comienza en el momento en que las cromátides se separan una de otra. Cada cromátide está unida a la fibra del huso a través de su centrómero y se dirige hacia los polos opuestos.
• Telofase: El final de la migración polar de los cromosomas hijos indica el comienzo de esta fase. Los cromosomas se descondensan, los nucléolos se reorganizan y la envoltura nuclear se forma paulatinamente alrededor de los cromosomas. Simultáneamente se produce la citocinesis, en las células vegetales por la formación del fragmoplasto y en las animales por el anillo contráctil de actina y miosina.

II. Materiales:

-Raíces de bulbo de cebolla (Allium cepa)

-Placa petri

-Láminas y laminillas

-Mechero de alcohol

-Orceína aceto clorhídrica al 2%

-Microscopio compuesto

-Papel absorbente

-Gillette

-Pinza

III. Procedimiento:

1. Escoger un bulbo de cebolla fresca.
2. Quitar las raíces y fibras secas de la base del bulbo.
3. Inserte tres palillos en el plano ecuatorial del bulbo, de modo que este pueda suspenderse en un pequeño vaso o recipiente con agua. La base del bulbo debe estar tocando justamente la superficie del agua. Las raíces empezarán a crecer en dos o tres días. Cambiar el agua diariamente.
4. Corte, con una pinza, las raíces del bulbo a 1 cm de la parte apical y colóquela en una superficie lisa donde pueda realizar un segundo corte, esta vez con la gillete, a 2 mm de la parte apical.
5. Coloque los cortes sobre una placa petri que contenga orceína aceto clorhídrica al 2%.
6. Caliente la placa en la llama de un mechero por un lapso de 3-4 segundos o hasta que pueda observar la emisión de vapores blancos. Este proceso deberá repetirse 3 o 4 veces dejando enfriar hasta la temperatura ambiente en los lapsos intermedios.
7. Después del último calentamiento deje enfriar y reposar durante 7 a 10 minutos.
8. Coloque una raicilla en una lámina añada una gota de orceína fría. Coloque una laminilla sobre ella.
9. Con el borrador de un lápiz realice un golpe seco en el centro de la laminilla y luego golpee suavemente de manera concéntrica para permitir la extensión del tejido meristemático. 
10. Elimine el exceso de colorante usando papel absorbente y realice el aplastamiento (squash).
11. Observe la preparación al microscopio.

Allium cepa, meristemo apical radicular, orceína aceto
clorhídrica, aumento 400X. A: Células en interfase.
B: Células diferenciadas. C: Células en telofase tardía.

Allium cepa, meristemo apical radicular, orceína aceto 
clorhídrica, aumento 400X. A: Célula en metafase.

Allium cepa, meristemo apical radicular, orceína aceto 

clorhídrica, aumento 400X. A: Célula en prometafase,

B: Célula en telofase temprana. C: Célula en metafase

Allium cepa, meristemo apical radicular, orceína aceto 

clorhídrica, aumento 400X. A: Célula en interfase.

B: Célula en prometafase. C: Célula en profase

D: célula en metafase

Allium cepa, meristemo apical radicular, orceína aceto 

clorhídrica, aumento 400X. A: Célula en anafase tardía

B: Células en metafase. C: Célula en profase. 

D: Célula en anafase. El puntero señala una célula 

anafase tardía.

Allium cepa, meristemo apical radicular, orceína aceto 

clorhídrica, aumento 400X. A: Célula en interfase

B: Célula en profase. C: Célula en anafase. 

D: Célula en metafase.

Allium cepa, meristemo apical radicular, orceína aceto 

clorhídrica, aumento 400X. A: Célula en interfase.

B: Célula en profase. C: Célula en metafase.

Índice de fases

A partir de estas micrografías podremos calcular el índice de fases del tejido meristemático. El índice de fases nos indica el porcentaje de células que se encuentran en determinada fase en un tejido. Es necesario calcular el índice de fases debido a que las células son asincrónicas, es decir, realizan su ciclo celular independientemente del resto. 

La aproximación más sencilla de la medida del ciclo celular que puede hacerse es contar un determinado número de células y ver cuántas de ellas están en mitosis y en que fase.

El indice mitótico se calcula como el cociente del número de células en mitosis con el número total de células contadas por 100. El indice de fases se determina como el cociente del número de células en una fase determinada con el número de células en mitosis por 100.

Los valores normales de los índices son los siguientes:

• Índice mitótico: 30%
• Índice de profase: 53.33%
• Índice de metafase: 13.33 %
• Índice de anafase: 6.67 %
• Índice de telofase: 26.67%

Fotosíntesis

Fotosíntesis 

I. Introducción:

Los organismos autótrofos son capaces de sintetizar su propio alimento en base a compuestos inorgánicos y energí, en su mayoría, radiante.

Los reactantes de esta reacción son el CO2 , agua y energía radiante que luego de un complicado proceso se convierten en hidratos de carbono y oxígeno.

En esta práctica constataremos que la fotosíntesis es un proceso real de tres maneras diferentes. Primero, mediante la observación directa de las estructuras en las que se realiza este proceso en las células eucariotas, es decir, los cloroplastos. Lo segundo es una muestra de los componentes moleculares más importantes de este proceso, hablamos de los pigmentos fotosintéticos; y para terminar tenemos una muestra de la utilización del CO2 de manera directa midiendo la acidez del medio. A continuación citamos los reactivos que serán necesarios para realizar esta práctica.

II. Materiales:

-Elodea sp. 
-Spinacia oleracea
-Geranium sp.
-Etanol
-Bencina
-Azul de Bromotimol
-Gasa
-Embudo 
-Gradilla
-Tijeras
-Sorbetes
-Placa Petri
-Gillete
-Mortero con pilón
-Papel filtro
-Agua destilada
-3 Tubos de ensayo de 10x15 mm con tapón
-Laminas y laminillas
-Microscopio óptico

III. Procedimiento: 

A. Sitio de fotosíntesis:

Preparar cortes transversales muy finos del envés de las hojas de geranio (Geranium sp.) y espinaca (Spinacia oleracea) y coloquelos sobre una gota de agua en una lamina. Cubra la muestra con una laminilla.

Sipinacea oleracea,  corte transversal del envés de la hoja,
no se ha utilizado tinción, aumento 400X. 

Geranium sp. Corte transversal del envés de la hoja,
no se ha utilizado tinción, aumento 400X.

Los cloroplastos solo pueden ser observados en las células oclusivas del estoma ya que las células epidérmicas carecen de ellos.

B. Obtención de pigmentos fotosintéticos:

1. Coloque en un mortero hojas de espinaca o geranio previamente lavadas y finamente picadas. Agregue 1 mL de etanol. Triture las hojas hasta obtener una suspensión homogénea.
2. Filtre el extracto con la ayuda de un embudo con gasa.
3. Coloque 1 mL del filtrado en un tubo de ensayo y agréguele 2 mL de bencina, agite y luego vacíelo en una placa Petri. Inmediatamente coloque papel filtro en forma de cono o triángulo sobre ella.
4. Observe la separación entre los pigmentos fotosintéticos por la diferencia en su recorrido en el papel filtro. 

Separación de los pigmentos por el peso molecular. De arriba
hacia abajo: Carotenos, Xantófilas, Clorofila A y Clorofila B

El papel filtro absorbe la solución de los pigmentos disueltos en bencina, la bencina se evapora rápidamente y deja a los solutos que estaban disueltos en ella impregnados al papel filtro. Pero la manera en la que estos pigmentos son arrastrados por el papel filtro no es uniforme, la longitud recorrida será inversamente proporcional al peso molecular de los pigmentos, de modo que los pigmentos que se encuentran en la parte más elevada son los más livianos y los que se quedan en la región baja del papel filtro son los más pesados. De este modo podemos separar a los pigmentos por sus masas moleculares, este método es conocido como cromatografía en papel.

C. Utilización del CO2:

1. Incorpore 10 mL de agua destilada a 2 tubos de ensayo y añada 2 gotas de azul de bromotimol a cada tubo.
2. Con la ayuda de un sorbete burbujee cada uno de los tubos soplando suavemente. Observe el cambio de coloración.
3. Sumerja en cada uno de los tubos un vástago de elodea (Elodea sp.) de aproximadamente 5 cm de longitud y tape los tubos. Coloque un tubo a plena luz y el otro en la oscuridad por espacio de 1 hora.
4. Observe los tubos y haga sus conclusiones.

A la derecha el tubo de ensayo que estuvo expuesto a la luz
y a la izquierda el que se mantuvo en la oscuridad.

El quid de este experimento es que el bromotimol es un tinte sensible al pH, a pH básico es amarillo y a pH básico es azul, de modo que al soplar con el sorbete lo que estamos haciendo es disolver CO2 en la solución. El CO2 reacciona con el agua formando ácido carbónico que acidifica la solución virando el color de la solución de azul a amarillo. 

Al introducir una rama de elodea y exponerla al Sol esta utiliza el CO2 del medio para realizar la fotosíntesis; al extraer el CO2 del medio le estaría devolviendo la basicidad que poseía y con ella su color azul mientras que la rama de elodea que se mantiene en la oscuridad no puede realizar la fotosíntesis por lo que no puede extraer CO2 del medio y por ello el color amarillo se mantiene.

Extraído y modificado de:

Guía de laboratorio de Biología celular UNMSM, Lazo F, Suyo M, Vivas D, Lima, 2016, pág 32-34.

Tipos básicos de tinción en células eucariotas

Tipos básicos de tinción en células eucariotas

Todos los organismos comparten los mismos constituyentes básicos: las células. Aunque las características de las células varían de una célula a otra, existen aspectos básicos que comparten todos los tipos celulares como son: Una membrana plasmática externa que rodea la célula, el modo de almacenamiento de la información (en polinucleótidos), un metabolismo que transforma su medio para satisfacer sus necesidades bioquímicas, todas las células establecen respuestas ante los estímulos tanto internos como externos a corto y largo plazo (irritabilidad y evolución), etc.

En esta práctica comprobaremos que son las células los constituyentes básicos de los organismos al observar muestras de tejidos tanto animal como vegetal. También observaremos las diferentes formas que pueden tomar las células tanto animales como vegetales y estableceremos tanto puntos en común entre ambos tipos celulares como sus divergencias. 

Materiales

-Microscopio compuesto.

-Láminas y laminillas.

-Solución de azul de metileno.

-Solución de lugol.

-Colorante Wright.

-Pinzas.

-Lancetas hematológicas.

-Hoja de afeitar.

-Goteros.

-Allium cepa (cebolla).

-Alcohol yodado, agua destilada.

-Algodón.

Desarrollo 

A. Observación de las células epiteliales de la mucosa bucal:

1. Cuidadosamente con el extremo de una lámina limpia o un hisopo, raspe la superficie interna de la mejilla; al hacer esto la fricción provocada entre el hisopo o lamina y la mejilla provocará que la célula se desprenda del tejido bucal y sea recogida por el hisopo o lamina.
2. Deposite el material obtenido en una lámina portaobjeto (frotis).
3. Secar al medio ambiente la lámina que contiene la muestra por 5 minutos.
4. Cubrir la muestra con azul de metileno durante 10 minutos.
5. Eliminar el exceso de colorante y lavar con agua corriente.
6. Secar la lámina y observar al microscopio.

Frotis bucal humano, células epiteliales de la mucosa bucal,
tinte: azul de metileno, aumento: 100X. Las células
poseen un aspecto amorfo con un núcleo intensamente teñido

Frotis bucal, células epiteliales de la mucosa bucal,
tinte: azul de metileno, aumento: 400X. 

B. Observación de las células epiteliales del catáfilo de cebolla (allium cepa):

Las células del catáfilo de la cebolla no poseen función fotosintética, por lo que no observaremos cloroplastos; sin embargo, si podremos visualizar otras estructuras celulares.

1. Extraiga un pequeño fragmento de la epidermis interna del catáfilo de cebolla.
2. Utilizando la lámina y laminilla, monte la preparación, coloreando con solución de lugol.
3. Observe al microscopio.

Allium cepa, catáfilo, se ha colocado la muestra en un medio
de lugol, aumento: 100X. Las células están apiladas, poseen formas
casi geométricas y carecen de cloroplastos,

C. Observación de formas de núcleo en leucocitos humanos:

Los leucocitos son un tipo celular del tejido conectivo con capacidades inmunológicas, se dividen en granulocitos y agranulocitos. Los granulocitos, a su vez, se dividen en eosinófilos, neutrófilos y basófilos. Los agranulocitos se subdividen en monocitos y linfocitos. Cada uno de estos tipos celulares posee características externas distintivas que nos permite reconocerlos. 

1. Desinfectar el dedo anular con alcohol yodado y algodón. Con una lanceta estéril punzar el dedo y dejar caer una gota de sangre sobre un extremos de la lámina portaobjetos.
2. Con ayuda de otra lámina formar un ángulo de 45º y realizar un frotis, tratando de esparcir homogéneamente la gota de sangre sobre la superficie de la lámina.
3. Dejar secar la preparación 5 minutos al ambiente y proceder luego a la coloración.
4. Cubrir el frotis con el colorante de Wright por 1 minuto.
5. Sin eliminar el colorante agregar agua destilada y dejar actuar por 10 minutos.
6. Eliminar luego el colorante y lavar suavemente con agua de caño.
7. Dejar secar la lámina coloreada.
8. Una vez que la lámina coloreada ha secado, observar al microscopio con el objetivo de inmersión y aceite de inmersión.

Extraído de:
Guía de laboratorio de Biología celular UNMSM, Lazo F, Suyo M, Vivas D, Lima, 2016, pág 11-14 .

Reconocimiento indirecto de la presencia de bacterias

Reconocimiento indirecto de la presencia de bacterias

Presentación

Aun si no poseemos el material necesario como para observar en forma directa la presencia de bacterias podemos determinar su existencia, aunque no de forma directa. Esto tiene aplicaciones directas ya que existen una serie de situaciones en las que incluso si tenemos la capacidad de observar a las bacterias directamente elegimos no hacerlo, muestra de esto es el test del aliento desarrollado para evitar realizarle una biopsia al paciente y en vez de ello analizar los compuestos producidos por los microorganismos, siendo estos compuestos propios solo de ellos.

En esta entrada analizaremos una de las formas básicas de evidenciar la presencia de bacterias.

Marco teórico

Las bacterias poseen una serie de enzimas implicadas en su metabolismo que extraen los átomos de hidrógeno de sustratos específicos, liberándolos al medio. Este grupo de enzimas es conocido como deshidrogenasas. En esta práctica no nos concentraremos en un tipo específico de enzima sino en los productos de estas: los hidrógenos.

Al adicionar azul de metileno a un medio contaminado con bacterias, y por ende que posee enzimas deshidrogenasas, este reacciona con los átomos de hidrógeno producidos y se reduce, al reducirse pierde su coloración azul y se torna translúcida. 

Con todo esto, si observamos que la muestra inicialmente teñida de azul por el azul de metilo se va decolorando hasta volver a su color original podemos tener la certeza de que ese medio posee átomos de hidrógeno que posiblemente hayan provenido de sustratos  del medio catalizados por las enzimas deshidrogenasas de las bacterias.

Materiales

-Cinco muestras de leche de diferente procedencia.

-Azul de metileno.

-Cinco tubos de ensayo 15x150 mm.
-Cinco tapones para tubo de ensayo.

-Goteros.

-Marcador indeleble.

-Baño María de laboratorio.

Procedimiento

1. Obtener cinco muestras de leche de diferente procedencia (en polvo, materna, fresca contaminada, yogurt bebible, evaporada).
2. Vierta 5 mL de las muestras en cinco tubos de ensayo diferentes.
3. Rotular con el marcador cada tubo de ensayo indicando su contenido.
4. Adicionar 2 gotas de azul de metileno a cada tubo.
5. Tapar cada tubo con el tapón estéril.
6. Colocar los tubos en baño María a 37ºC,  esperar una hora.

Resultados y conclusiones

La siguiente tabla muestra la coloración inicial de las diferentes muestras:

Una vez transcurrido el tiempo observamos todas la muestras, excepto la muestra de leche contaminada, mantienen su coloración inicial. 

A partir de estos resultados confirmamos la presencia de enzimas deshidrogenasas en la leche contaminada y con ella la presencia de bacterias en ella.

Este experimento puede ser repetido con otros medios líquidos como agua estancada, agua potable y agua de río, etc. Un posible inconveniente es la sensibilidad de este experimento ya que requiere de una gran población bacteriana para poder evidenciar un cambio en la coloración, esto limita el tipo de muestras que pueden ser analizadas. Este inconveniente óptico puede ser corregido utilizando un espectrofotómetro para encontrar la variación en la coloración.

Extraído de:
Guía de laboratorio de Biología celular UNMSM, Lazo F, Suyo M, Vivas D, Lima, 2016, pág 8, 9 y 10 .

Tinción de Gram

Tinción de Gram

Es la coloración más empleada en bacteriología, fue propuesta por el microbiólogo danés Christian Gram en 188. Esta técnica permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias: Gram positivas (+) y Gram negativas (-). Su fundamento radica en la diferencia estructural a nivel de su pared celular en ambos grupos. Ello se debe a la precipitación a nivel del citoplasma del cristal violeta con la solución de Lugol, formando un compuesto insoluble Cristal violeta-Lugol;  en algunas bacterias (Gram +) no se puede extraer con solvente alcohol-acetona, mientras que en otras (Gram -) sí se puede extraer. Debido a que las Gram negativas no se puede teñir de cristal violeta, se necesita una tinción de fondo con safranina o fucsina básica para permitir su visualización. 

Las bacterias Gram positivas poseen una pared celular bastante gruesa que rodea a la membrana citoplasmática; se compone de peptidoglicano o mureina y ácidos teicoicos.

Las Gram negativas tienen una pared celular más delgada que se encuentra  rodeada por una membrana externa, es decir, las bacterias gram negativas presentan dos membranas. La membrana externa presenta una molécula denominada lipopolisacárido o LPS.

Procedimiento de la coloración Gram

1. Prepara el frotis de la muestra en un portaobjetos limpio.
2. Fijar la muestra a la llama del mechero en forma suave.
3. Cubrir la preparación con cristal violeta o violeta de genciana y dejar actuar por un minuto.
4. Lavar con agua destilada.
5. Cubrir el preparado con lugol y dejar actuar por un minuto.
6. Lavar con agua destilada.
7. Decolorar con alcohol acetona hasta que no se desprenda más colorante.
8. Lavar con agua destilada.
9. Cubrir la preparación con safranina o fucsina de Ziehl y dejar actuar por 30 segundos. 
10. Lavar con agua destilada.
11. Secar la preparación y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

Resultado

Las bacterias Gram positivas aparecen de color violeta y las Gram negativas de un color rosado o granate. A continuación se mostrarán algunos ejemplos de bacterias tanto Gram positivas como negativas.

Bacterias Gram positivas

Bacillus sp

Streptococcus mutans

Staphylococcus sp

Bacterias Gram negativas

Salmonella sp

Escherichia coli

Neisseria sp.

Extraído de: Tomás Agurto S., Técnicas de coloraciones de células y tejidos, editorial Imprenta Unión, pag 88-89.

Coloración de bacterias, aspectos teóricos

COLORACIÓN DE BACTERIAS, ASPECTOS TEÓRICOS

Colorante: 

Es aquella sustancia que tiene la propiedad de comunicar color a otros cuerpos de cualquier naturaleza. Para que una sustancia se comporte como un colorante debe estar compuesto por:

Cromógeno:  Son las moléculas que poseen potencialidades de coloración, conferido por un radical llamado cromóforo.

Cromóforo:  Grupo de átomos no saturados , susceptibles a dar coloración a las moléculas de las cuales forman parte, la fuerza de los cromóforos varía con la naturaleza de sus átomos y de su estructura. 

Auxócromo: Grupo de átomos no saturados, debido a esta insaturación influye y pueden ser: simples (Presentan un átomo no saturado p. ej el NH2) o compuestos (Cuando cada uno encierra dos átomos no saturados p. ej. NHNH2).

Mordiente:

Son sustancias que actúan entre el tejido y el colorante para que formen sales, de esta manera la coloración queda fijada fuertemente, puede ser colocado sobre el preparado antes o después de la acción del colorante principal, así, el fenol y oxalato de amonio se mezclan con el cristal violeta como colorante en el método Gram. Las estructuras bacterianas se colorean por diversos procedimientos con colorantes propios de cada estructura: Cápsula, espora, flagelo, corpúsculos metacromáticos, membranas y las formas ácido resistentes.

Tipos de colorantes:

1. De acuerdo a su origen:

 a) Naturales: Colorantes obtenidos a partir de la naturaleza ya sea de fuentes animales o vegetales.        Ejemplo: Carmín, hematoxilina.

 b) Artificiales: Colorantes obtenidos mayormente como derivado del alquitrán de hulla. Ejemplo:          Cristal violeta, safranina, etc.

2. De acuerdo a su composición química: 

 a) Básicos: Colorante que en su parte cromófora llevan carga eléctrica positiva, la que tendría una fuerte afinidad por los grupos electronegativos que normalmente presentan las bacterias en su protoplasma como los ácidos nucleidos y derivados. Ejemplo: Fucsina básica, Violeta de metilo, Cristal violeta, etc.

 b) Ácidos: Colorantes que en su parte cromófora lleva cargas eléctricas negativas que tienen fuerte afinidad por los componentes electropositivos de la célula (citoplasma). Ejemplo: Anaranjado de metilo, Pardo Bismarck, Ácido fénico, etc.

 c) Neutro: Resulta de la combinación de los colorantes ácidos y básicos.

Métodos de coloración:

Coloración simple:

Empleado para comprobar la presencia de microorganismos en cualquier material, revelar tamaño, forma y disposición de las células microbianas. Se puede utilizar colorantes ácidos o básicos los que reaccionarán con la célula más no así con el medio que la rodea.

Coloración diferencial:

Los microorganismos difieren física y químicamente entre sí y por esto reaccionan de una manera distinta frente  a un determinado procedimiento de tinción. En una metodología de tinción que permite distinguir los diferentes tipos de bacterias es necesaria la utilización de más de un tipo de tinte para contrarrestar los tipos de bacterias. Un ejemplo de esta es la tinción Gram.

-Extraído de: Tomás Agurto Sáenz, técnicas de coloraciones de células y tejidos en microbiología, parasitología e histología, Editorial imprenta  unión, 2007, pág  87, 88.